微量凯氏定氮法原理

经典的蛋白质含量测定方法。通过测定样品中氮的含量，进而推算出蛋白质的浓度。

步骤：

• 样品与浓硫酸共热，含氮有机物分解产生氨。

• 氨与硫酸作用形成硫酸氨。

• 通过强碱碱化使之分解释放出氨。

• 通过滴定定量。

紫外-可见光谱法原理

基于蛋白质中的芳香族氨基酸残基（如色氨酸和酪氨酸）能吸收紫外光的特性。

步骤：

• 测量溶液在特定波长（通常是280nm）下的吸光度。

• 根据吸光度和摩尔消光系数计算蛋白质浓度。

Bradford蛋白测定法原理

基于布拉德福德染料与蛋白质结合后颜色变化的原理。

步骤：

• 将布拉德福德试剂与待测蛋白样品混合。

• 染料与蛋白质结合，通常由蓝色变为紫色,加完试剂2-5min。

• 在595nm处测量吸光度变化。

• 根据标准曲线计算蛋白质浓度。

Lowry蛋白测定法原理

过去的常用方法。基于酚酞试剂与蛋白质中的肽键反应，产生蓝色复合物。可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。

步骤：

• 将酚酞试剂加入待测蛋白样品中。

• 加入铜试剂作为催化剂。

• 在650-750nm处测量吸光度。

• 根据标准曲线计算蛋白质浓度。

BCA蛋白测定法原理

改良的Lowry法，使用二喹啉酸（bicinchoninic acid）作为反应剂。本方法将双缩脲反应和显色反应结合在一起:前者为在碱性介质中，蛋白质可将Cu2+还原成Cu1+的反应，后者为使用含有二喹啉甲酸(BCA)的独特试剂，利用比色法检测Cu1+，具有高灵敏度和高选择性的特点。

此检测方法中产生的紫色显色物质是由两分子的BCA和一分子的亚铜离子整合而形成的。该水溶性复合物在562nm处具有很强的吸光值，在很宽的蛋白质浓度范围(20-2000ug/mL)内，吸光值和蛋白质浓度具有良好的线性关系。

步骤：

• 将BCA工作液加入待测蛋白样品中，在每一个孔中加入200uL工作液，并在震荡器上震荡30秒，使其充分混合。

• 在37℃下孵育30min。

• 在562nm处测量吸光度。

• 根据标准曲线计算蛋白质浓度。

比浊法原理

通过测量溶液中悬浮颗粒对光的散射程度来估计蛋白质浓度。

步骤：

• 使用比浊计或分光光度计测量样品的浊度。

• 根据标准曲线计算蛋白质浓度。

毛细管电泳原理

利用蛋白质在电场作用下迁移速度的差异进行分离和定量。

步骤：

• 准备毛细管电泳仪和样品。

• 加载样品并进行电泳。

• 分析电泳图谱，根据迁移时间和峰面积计算蛋白质浓度。

免疫测定法（如ELISA）原理

通过特异性抗体与蛋白质的结合来测定特定蛋白质的含量。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即：用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。

步骤：

• 加样：加一定稀释的待检样品100μL于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1h。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

• 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(按照说明书进行稀释)100μL。37℃孵育0.5～1h，洗涤3次。

• 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100μL，37℃10～30min。

• 加入终止液后30 min内，使用酶标仪测量450nm的吸光度值，设定540nm或570nm作为校正波长。如果没有使用双波长校正，结果准确度可能会受影响。

计算结果：将每个标准品和样品的校正吸光度值(OD450-OD540/OD570)、复孔读数取平均值，然后减去平均零标准品OD 值。使用计算机软件作四参数逻辑(4-PL)曲线拟合创建标准曲线。另一种方法是，可以通过绘制标准品浓度做对数与相应OD 值对数生成曲线，并通过回归分析确定最佳拟合线。这个过程可生成一个足够使用但不太精确的数据拟合。