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ELISA实验样本的处理方法

ELISA检测常见样本的收集及处理方法

(方法仅供参考)

一、 液体样本的处理

1. 血清样本

取新鲜血液,在 25℃条件下静置 30 min 使血液凝结。4℃, 2000×g 离心 15 min,取上层淡黄色澄清液体即为血清。血清置于冰上待测,若 不能当天检测,于 -80℃保存,可储存一个月。

2. 血浆及红细胞样本

取新鲜血液加入含有抗凝剂的试管中, 颠倒混匀,4℃,700-1000×g 离心 10min,取上层淡黄色透明液体即为血浆, 不能吸取中间白色干扰层(白 细胞和血小板)。将血浆置于冰上待测,若不能当天检测,于 -80℃保存,可储存一个月。

将中间白色干扰层舍去,将下层红细胞沉淀,用 4 倍体积 2-8℃的超纯水裂解,于 4℃, 10000×g离心 15 min ,上清液即为红细胞溶解物。

3. 全血样本

取新鲜血液加入到盛有抗凝剂的管中,轻轻颠倒混匀,置于冰上待测。若不能当天检测测,4℃保存 2 天。

4. 尿液样本

收集新鲜尿液, 4℃, 10000×g 离心 15min,取上清于冰上待测。若不能当天测,放入 -80℃保存,可储存一个月。

5. 胸水样本

收集新鲜胸水, 加入含有抗凝剂的试管中, 4℃, 1500×g 离心 10min,取上清于冰上待测, 若不能当天测, 保存在 -80℃中, 可储存一个月。

6. 脑脊液样本

将收集的脑脊液, 4℃, 1500×g 离心 10min,取上清于冰上待测,若不能当天测,保存在 -80℃中,可储存一个月。

7. 脑脊液样本

① 高速离心法:

4℃, 10000×g离心 15 min 后,用棉签吸弃上层乳白色液体,吸取中层澄清血清于冰上待测。

② 乙醚萃取法:

取血清与乙醚 1:1 混合, 涡旋混匀仪震荡 30 秒, 室温静置 5 分钟, 4℃, 1500×g 离心 5min,枪头穿过乙醚层, 取下层清亮血清进行测量。 [1]

③ 生理盐水稀释法:

将血清与生理盐水按照 1:4  (具体稀释倍数按照指标确定)稀释后混匀待测(适用于轻度高脂样本)。

④ 沉淀分离法:

将血清用联合沉淀剂磷钨酸 - 镁沉淀剂或者聚乙二醇 - 硫酸葡聚糖沉淀剂沉淀 [2] ,4℃, 1500×g离心 10 min 后,取上清待测。(具体沉 淀剂的种类及浓度需要按指标确定)。

 

二、 细胞、组织及菌类等需匀浆处理的样本的处理

悬浮细胞:

4℃, 1000-2000×g 离心 10min 收集细胞, 按照 106 个细胞加入 300-500 μL 匀浆介质的比例加入匀浆介质, 进行机械匀浆, 充分破碎(无 明显的细胞沉淀, 可在显微镜下观察) ,4℃, 10000×g 离心 10min,取上清置于冰上待测, 若不能当天检测, 于 -80℃保存, 可保存一个月。

贴壁细胞:

吸弃培养液, PBS (0.01 M,pH 7.4) 将细胞洗一遍。用细胞刮刮下细胞(不能用胰酶和 EDTA 处理) ,加入2-5 mL PBS (0.01 M,pH 7.4), 收集细胞悬液,后处理方法见悬液细胞处理方法。取 0.020-1.0 g 新鲜组织块,用 2-8℃的 PBS  (0.01 M ,pH 7.4)漂洗,去除血液,滤纸吸干,称重,放入匀浆容器中,按照重量(g):体积 (mL) =1:9 的比例加入 2-8℃的匀浆介质, 进行匀浆, 4℃, 10000×g 离心 10min,取上清置于冰上待测, 若不能当天检测, 于 -80℃保存,将 10% 组织匀浆, 4℃, 1500×g 离心 10 min,将上清液 4℃, 10000×g 离心 15 min,弃去上清, 沉淀即为线粒体。加入匀浆介质溶解后待测。

取新鲜组织块(20 mg-1.0g) ,按照重量(g): 体积(mL) =1:9 的比例加入 2-8℃的匀浆介质,进行匀浆,4℃, 1500×g 离心 10 min,用 棉签吸弃上层乳白色液体,吸取中层澄清液体待测。

将菌液于 4℃、 1000-2000×g 离心 10 min 收集细菌,用 PBS  (0.01 M ,pH 7.4)将菌沉淀洗 2-3 遍,然后按照原菌液体积的 1/5-1/10 加入裂 解液(一般为 50 mM Tris-HCl,pH 8.0,2mM EDTA,100 mM NaCl,加溶菌酶至 100 ug/ml,0.1% Triton X-100,具体情况根据所测指标选择) 重悬菌体,在冰水浴条件下,超声破碎(条件一般是 300w,超声 10s 间隔 10s,总时间 10 分钟,具体条件可根据自身情况而定)。

如何判断是否超声完全:

① 外观判断: 超声前菌悬液是浑浊的,超声完全后变的透明、清澈。

② 液体的粘滞性: 超声后菌液从枪头滴下不粘连。

③ 高速离心: 有用高速离心检测超声破碎程度的(一般用 6000×g 离心 10min,比一般离心收集菌体的转速高一点)。沉淀是未破碎或破碎 不完全的菌体。

一些需要注意的问题:

① 如果超声时出现黑色沉淀,说明超声功率太强。

② 超声时间太长、功率太高对蛋白活性肯定有影响。

③ 尽量防止泡沫的产生。

 

 

一、 匀浆方式

1. 手工匀浆

将组织称重,剪碎呈 1 cm3 大小,倒入玻璃匀浆管中,加入匀浆介质,左手持匀浆管将下端置于冰浴中,右手将捣杆垂直插入套管中,上下转 动研磨数十次(6~ 8 min) ,组织充分匀浆;或者倒入研钵中,加入液氮进行研磨,充分研磨后,加入匀浆介质,再将制好的组织匀浆吸取 到 EP 管中备用。

2. 机械匀浆

将称重的组织装入 EP 管, 加入匀浆介质, 用组织匀浆机, 在冰水浴, 60Hz, 90s 条件下研磨制成组织匀浆, 皮肤、肌肉组织及植物组织等可适 当延长匀浆时间。

3. 超声波破碎

用超声波发生器以振幅 14 μm 超声处理 30 s ,破碎细胞;或者用超声波破碎仪, 200 W ,2 s/ 次,间隙 3s,总时间 5 min。

4. 反复冻融

将细胞在 -20℃以下冰冻,室温融解,反复几次(至少 3 次)。此方法不适用于酶活检测试剂盒。

二、 实验室常见抗凝剂的种类

1. 肝素

常用的肝素抗凝剂是肝素的钠、钾、锂、铵盐,其中以肝素锂最好。通常肝素抗凝剂量为 10.0-12.5 IU/mL 血液。

2. 草酸盐

常用的草酸盐有草酸钠、草酸钾、草酸铵,通常为 0.1 M 与血液按照 1:9 的体积比混合抗凝。

3. 枸橼酸盐

主要是枸橼酸钠,通常以二水合枸橼酸钠配置成 3.8% 或者 3.2% 的水溶液,与血液按照 1:9 的体积比混合抗凝。

4. 乙二胺四乙酸盐(EDTA 盐)

常用的 EDTA 盐有钾、钠、锂盐,推荐使用 EDTA 钾盐(溶解度最高、抗凝速度最快),通常配成 15% 的水溶液(质量分数),每5 mL 血液加 0.04mL 15% EDTA 溶液抗凝。

三、常见匀浆介质配方

生理盐水 0.9% NaCl

0.01 M PBS  (pH7.4) 8 mM Na2 HPO4 、136mM NaCl 、2 mM KH2 PO4 、2.6mM KCl

生物匀浆液 20 mM Hepes-KOH  (pH7.2)、 210 mM 甘露醇、 70 mM 蔗糖、 1 mM EGTA

NP-40 细胞 / 组织裂解液 10 mM Tris-HCl  (pH7.4)、 10 mM NaCl 、15 mM MgCl2 、250 mM 蔗糖、 0.01 mM EGTA 、0.5% NP-40