ELISA检测常见样本的收集及处理方法

(方法仅供参考)

一、 液体样本的处理

1. 血清样本

取新鲜血液，在 25℃条件下静置 30 min 使血液凝结。4℃， 2000×g 离心 15 min，取上层淡黄色澄清液体即为血清。血清置于冰上待测，若 不能当天检测，于 -80℃保存，可储存一个月。

2. 血浆及红细胞样本

取新鲜血液加入含有抗凝剂的试管中， 颠倒混匀，4℃，700-1000×g 离心 10min，取上层淡黄色透明液体即为血浆， 不能吸取中间白色干扰层(白 细胞和血小板)。将血浆置于冰上待测，若不能当天检测，于 -80℃保存，可储存一个月。

将中间白色干扰层舍去，将下层红细胞沉淀，用 4 倍体积 2-8℃的超纯水裂解，于 4℃， 10000×g离心 15 min ，上清液即为红细胞溶解物。

3. 全血样本

取新鲜血液加入到盛有抗凝剂的管中，轻轻颠倒混匀，置于冰上待测。若不能当天检测测，4℃保存 2 天。

4. 尿液样本

收集新鲜尿液， 4℃， 10000×g 离心 15min，取上清于冰上待测。若不能当天测，放入 -80℃保存，可储存一个月。

5. 胸水样本

收集新鲜胸水， 加入含有抗凝剂的试管中， 4℃， 1500×g 离心 10min，取上清于冰上待测， 若不能当天测， 保存在 -80℃中， 可储存一个月。

6. 脑脊液样本

将收集的脑脊液， 4℃， 1500×g 离心 10min，取上清于冰上待测，若不能当天测，保存在 -80℃中，可储存一个月。

7. 脑脊液样本

① 高速离心法：

于 4℃， 10000×g离心 15 min 后，用棉签吸弃上层乳白色液体，吸取中层澄清血清于冰上待测。

② 乙醚萃取法：

取血清与乙醚 1:1 混合， 涡旋混匀仪震荡 30 秒， 室温静置 5 分钟， 4℃， 1500×g 离心 5min，枪头穿过乙醚层， 取下层清亮血清进行测量。 [1]

③ 生理盐水稀释法：

将血清与生理盐水按照 1:4  (具体稀释倍数按照指标确定)稀释后混匀待测(适用于轻度高脂样本)。

④ 沉淀分离法：

将血清用联合沉淀剂磷钨酸 - 镁沉淀剂或者聚乙二醇 - 硫酸葡聚糖沉淀剂沉淀 [2] ，4℃， 1500×g离心 10 min 后，取上清待测。(具体沉 淀剂的种类及浓度需要按指标确定)。

二、 细胞、组织及菌类等需匀浆处理的样本的处理

悬浮细胞：

4℃， 1000-2000×g 离心 10min 收集细胞， 按照 106 个细胞加入 300-500 μL 匀浆介质的比例加入匀浆介质， 进行机械匀浆， 充分破碎(无 明显的细胞沉淀， 可在显微镜下观察) ，4℃， 10000×g 离心 10min，取上清置于冰上待测， 若不能当天检测， 于 -80℃保存， 可保存一个月。

贴壁细胞：

吸弃培养液， 用 PBS (0.01 M，pH 7.4) 将细胞洗一遍。用细胞刮刮下细胞(不能用胰酶和 EDTA 处理) ，加入2-5 mL PBS (0.01 M，pH 7.4)， 收集细胞悬液，后处理方法见悬液细胞处理方法。取 0.020-1.0 g 新鲜组织块，用 2-8℃的 PBS  (0.01 M ，pH 7.4)漂洗，去除血液，滤纸吸干，称重，放入匀浆容器中，按照重量(g)：体积 (mL) =1:9 的比例加入 2-8℃的匀浆介质， 进行匀浆， 4℃， 10000×g 离心 10min，取上清置于冰上待测， 若不能当天检测， 于 -80℃保存，将 10% 组织匀浆， 4℃， 1500×g 离心 10 min，将上清液 4℃， 10000×g 离心 15 min，弃去上清， 沉淀即为线粒体。加入匀浆介质溶解后待测。

取新鲜组织块(20 mg-1.0g) ，按照重量(g)： 体积(mL) =1:9 的比例加入 2-8℃的匀浆介质，进行匀浆，4℃， 1500×g 离心 10 min，用 棉签吸弃上层乳白色液体，吸取中层澄清液体待测。

将菌液于 4℃、 1000-2000×g 离心 10 min 收集细菌，用 PBS  (0.01 M ，pH 7.4)将菌沉淀洗 2-3 遍，然后按照原菌液体积的 1/5-1/10 加入裂 解液(一般为 50 mM Tris-HCl，pH 8.0，2mM EDTA，100 mM NaCl，加溶菌酶至 100 ug/ml，0.1% Triton X-100，具体情况根据所测指标选择) 重悬菌体，在冰水浴条件下，超声破碎(条件一般是 300w，超声 10s 间隔 10s，总时间 10 分钟，具体条件可根据自身情况而定)。

如何判断是否超声完全：

① 外观判断： 超声前菌悬液是浑浊的，超声完全后变的透明、清澈。

② 液体的粘滞性： 超声后菌液从枪头滴下不粘连。

③ 高速离心： 有用高速离心检测超声破碎程度的(一般用 6000×g 离心 10min，比一般离心收集菌体的转速高一点)。沉淀是未破碎或破碎 不完全的菌体。

一些需要注意的问题：

① 如果超声时出现黑色沉淀，说明超声功率太强。

② 超声时间太长、功率太高对蛋白活性肯定有影响。

③ 尽量防止泡沫的产生。

附 录

一、 匀浆方式

1. 手工匀浆

将组织称重，剪碎呈 1 cm3 大小，倒入玻璃匀浆管中，加入匀浆介质，左手持匀浆管将下端置于冰浴中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转 动研磨数十次(6~ 8 min) ，组织充分匀浆；或者倒入研钵中，加入液氮进行研磨，充分研磨后，加入匀浆介质，再将制好的组织匀浆吸取 到 EP 管中备用。

2. 机械匀浆

将称重的组织装入 EP 管， 加入匀浆介质， 用组织匀浆机， 在冰水浴， 60Hz， 90s 条件下研磨制成组织匀浆， 皮肤、肌肉组织及植物组织等可适 当延长匀浆时间。

3. 超声波破碎

用超声波发生器以振幅 14 μm 超声处理 30 s ，破碎细胞；或者用超声波破碎仪， 200 W ，2 s/ 次，间隙 3s，总时间 5 min。

4. 反复冻融

将细胞在 -20℃以下冰冻，室温融解，反复几次(至少 3 次)。此方法不适用于酶活检测试剂盒。

二、 实验室常见抗凝剂的种类

1. 肝素

常用的肝素抗凝剂是肝素的钠、钾、锂、铵盐，其中以肝素锂最好。通常肝素抗凝剂量为 10.0-12.5 IU/mL 血液。

2. 草酸盐

常用的草酸盐有草酸钠、草酸钾、草酸铵，通常为 0.1 M 与血液按照 1:9 的体积比混合抗凝。

3. 枸橼酸盐

主要是枸橼酸钠，通常以二水合枸橼酸钠配置成 3.8% 或者 3.2% 的水溶液，与血液按照 1:9 的体积比混合抗凝。

4. 乙二胺四乙酸盐(EDTA 盐)

常用的 EDTA 盐有钾、钠、锂盐，推荐使用 EDTA 钾盐(溶解度最高、抗凝速度最快)，通常配成 15% 的水溶液(质量分数)，每5 mL 血液加 0.04mL 15% EDTA 溶液抗凝。

三、常见匀浆介质配方

生理盐水 0.9% NaCl

0.01 M PBS  (pH7.4) 8 mM Na2 HPO4 、136mM NaCl 、2 mM KH2 PO4 、2.6mM KCl

生物匀浆液 20 mM Hepes-KOH  (pH7.2)、 210 mM 甘露醇、 70 mM 蔗糖、 1 mM EGTA

NP-40 细胞 / 组织裂解液 10 mM Tris-HCl  (pH7.4)、 10 mM NaCl 、15 mM MgCl2 、250 mM 蔗糖、 0.01 mM EGTA 、0.5% NP-40