ELISA常见问题及解答

Q: 什么是ELISA？ELISA的常见步骤是什么？

ELISA是酶联免疫吸附试验的缩写，用于检测特定蛋白质的存在并确定其浓度。ELISA包括三种类型：“夹心法”（sandwich ELISA）、竞争法（competitive ELISA）和间接法（indirect ELISA）。常见的步骤包括储存、试剂准备、ELISA板处理、样本或试剂加入、孵育、洗涤和读取。请参考我们的说明书以获取详细信息。

Q:UpingBio的ELISA试剂盒适用于哪种物种？能否在说明书未提及的物种中使用你们的ELISA试剂盒？

不同的ELISA试剂盒适用于不同的物种，包括人类、大鼠、马、兔、小鼠、绵羊、猪、牛、狗、鸡、鱼、猴子、植物等。请参考每个试剂盒的说明书以了解适用的物种。对于不同的物种，抗体的特异性和基质干扰也会有所不同。如果您在寻找适用于您所需物种的试剂盒方面遇到困难，可点击右侧在线联系客服，我们可以为您推荐合适的试剂盒。

Q:UpingBio的ELISA试剂盒进行了哪些质量控制和性能评估？

UpingBio的ELISA试剂盒都在严格的质控标准下对下述指标进行了仔细评估，包括：线性范围、线性、检测下限、精密度、回收率、稳定性、特异性和天然样品检测等，以确保良好的性能。点击此处了解更多关于质量控制的信息。

Q:UpingBio的ELISA试剂盒中是否包含标准品或对照品？

我们在定性ELISA试剂盒中提供阳性和阴性对照品，而在定量ELISA试剂盒中，我们提供可以作为质量控制的标准品。试剂盒的标准品和整个试剂体系是相匹配的。通过实验，客户可以绘制出良好的标准曲线，证明包括标准品在内的整个系统运行良好，因此标准品可以发挥质量控制的作用。建议对标准品进行复孔。

Q: 每次测试中需要做多少次ELISA标准品和样本？

建议每个标准品和样本都做复孔。

Q: 可以混合使用两种不同ELISA试剂盒的试剂吗？是否能只购买试剂盒中的标准品/抗体？

不可以，不同批次号的ELISA试剂盒中的试剂不能混合使用，而且我们不单独销售试剂盒中的组分。希望您能理解。

Q:UpingBio的试剂盒中是否添加了BSA和防腐剂？你们的终止溶液是什么？

ELISA试剂盒中的某些组分含有BSA。我们在大多数ELISA试剂盒中使用商业Proclin 300作为防腐剂，2N硫酸作为终止溶液。

Q: 可以在室温下进行孵育吗？

除了食品安全和药物残留ELISA试剂盒外，所有ELISA试剂盒的孵育温度均为37℃，因为这是抗原和抗体结合的最佳温度。我们不建议在室温下进行孵育，因为室温不稳定。

Q: TMB是什么？为什么在使用TMB系统测试样本时应该使用双光谱？

TMB（3,3',5,5'－四甲基联苯胺）是ELISA中使用的显色底物。TMB可以作为氢供体，通过过氧化酶（如辣根过氧化酶）催化过氧化氢的还原反应，将其转化为水。加入终止溶液后，反应停止，孔中发展的颜色从蓝色变为黄色。吸光度值应该在450 nm波长下测量。我们建议使用双光谱测试样本，以避免底部的干扰和划痕导致的误差。

Q: 当加入终止溶液后，为什么整个板孔中会出现黄色或浅黄色？

可能存在的原因有：

a. 添加的试剂不正确。您应该检查试剂的成分和批号，确保使用的是试剂盒中正确的试剂。

b. 洗板不充分。您应该确保在每个洗涤步骤中，所有孔中的缓冲液体积相同。在最后一次洗涤后，用纸巾强力吸干板上的残留缓冲液。

c. 移液管头或显色试剂容器受到酶偶联物的污染，或空白孔受到阳性对照物的污染。您应该在试剂之间更换移液管头，并为每个试剂使用单独的储液池。操作过程中使用移液器。

d. 底物暴露在光线下或在使用前受到污染。在准备投入孔中之前，应将底物放置在黑暗中保存。

e. 检测抗体或亲和素-HRP的浓度过高。您应该检查计算或进一步稀释后再次尝试。

f. 孵育时间或显色时间过长。您应严格按照试剂盒的方案进行操作。

g. 在读取时使用了错误的波长。波长应为450nm，对于TMB还应进行650nm波长校正。

Q: 当显色完成后，为什么整个板孔中包括阳性对照的孔中没有发展出任何颜色？

可能存在的原因有：

a. 使用了错误的试剂。在准备或使用时，请仔细检查标签。

b. 在洗涤或样品加入步骤中，由于酶偶联物的污染，导致显色试剂失活。您应确保酶偶联物容器中没有酶抑制剂。检查并确保洗涤缓冲液容器干净。

c. 错误地使用了某个试剂或步骤。您应仔细阅读试剂盒的方案，并严格遵循每个步骤。

Q: 为什么标准品和样本的孔中出现了弱颜色？

可能存在的原因有：

a. 试剂过期或储存不当。您应按照试剂盒的方案进行良好的储存，并在过期日期之前使用。避免污染。

b. 使用前，试剂和样本未达到室温。您应将所有试剂和样本放置在室温下30分钟。

c. 移液吸液不足，吐液速度过快，吸液管壁上液体过多或吸液管壁不洁净。您应使用校准过的移液器，确保移液管头与其完全匹配，并缓慢移液。建议一次性使用。

d. 孵育时间不足。您应准确设置计时器。

e. 显色时间不足。您应在15—30分钟内进行显色。通常情况下，20分钟是最佳时间，除非另有指示。

f. 显色试剂添加顺序错误。您应严格按照试剂盒的方案进行操作。

g. 过多的洗涤或浓缩洗涤缓冲液稀释不当。您应减少洗涤的冲击力：稀释浓缩洗涤缓冲液，控制洗涤时间，并根据手册记录洗涤次数和剂量。

h. 水质不合格。当准备洗涤缓冲液完成后，请检查并确保其pH为中性。

i. 在洗涤或样品加入步骤中，由于酶偶联物的污染，导致显色试剂失活。您应确保酶偶联物容器中没有酶抑制剂。检查并确保洗涤缓冲液容器干净。确保纯净水没有污染。

Q: 为什么标准曲线看起来正常，但是样本的孔中出现了弱颜色？

可能存在的原因有：

a. 样本中的NaN3防腐剂抑制了酶的反应。您应避免在样本中使用此防腐剂。

b. 在检测的样本中没有强阳性样本，结果是正常的。如果您有任何疑问，应重复试验。

Q: 为什么以肉眼看结果正常但读数较低？

在读数时使用了错误的滤光片。波长应为450nm，并使用650nm波长校正TMB。

Q: 为什么重复性差？

可能存在的原因有：

a. 试剂盒储存不当或储存环境差。您应按照数据表上的建议储存所有组分，而不是在室温下过长时间。

b. 标准的制备不正确。您应根据试剂盒的方案，使用推荐的稀释剂严格重构标准。在使用前的10分钟内准备好试剂，并迅速加入孔中。

c. 添加样本后混匀不充分。当同时添加多个试剂时，您应在涡旋混合器中充分混合试剂。在持有试剂时要小心，避免溅出。

d. 孔读数重复性差。您应校准酶标仪。

e. 孵育时间、洗涤条件、显色条件和操作者不一致。您应重复标准的实验。确保反应条件和操作者一致。

f. 洗涤不当。您应使用移液管加入200μL的洗涤缓冲液，或者用移液管充分填满每个孔，但不允许溢出。检查酶标板洗涤器的所有孔口，确保充分的洗涤。

g. 温度不均匀。您应在孵育期间保持恒定温度，避免温度波动。

h. 加样本时壁面残留过多或移液管尖端划伤孔底。您应缓慢、小心地将移液管尖端沿孔壁降低，避免触碰孔底。

i. 重复使用材料。您应在样本之间更换移液管尖端，在试剂之间更换储液器。

j. 偶尔在截断值附近出现的阳性和阴性值。您应对同一样本设置3个重复测量，并在2个样本中获得相同的结果。

k. 加样本时的交叉污染。您应在添加样本时避免交叉污染。

Q：为什么出现异常颜色？

可能存在的原因有：

a. 手动洗涤时发生交叉污染。您应在手动洗涤时，在填充洗涤缓冲液3次后立即将孔中液体清除，并在下一次设定浸泡时间以减少交叉污染。

b. 敲击酶标板时发生交叉污染。您应在敲击酶标板时使用适当的纸巾。不要将无关材料带入酶标板中。不要在同一位置敲击以避免交叉污染。

c. 样本长时间储存导致污染。您应保持样本新鲜，或在低温下储存以避免污染。

d. 由于孔洗涤器堵塞而导致填充不足或残留过多引起的异常发展颜色。您应使用移液管充分填满每个孔，但不允许溢出。检查酶标板洗涤器的所有孔口，确保充分的洗涤。

e. 样本离心不完全导致凝固物或沉淀物的凝结或干扰。您应完成血清和血浆的离心。

f. 洗涤缓冲液的准备错误或浓缩洗涤缓冲液的错误使用。您应按照手册的要求准备洗涤缓冲液。

Q: 孔板是否预涂层？如果无法一次性使用完剩余的孔或孔板，应该如何储存？

是的，酶标板是预包被的。建议将需要进行试验的孔单独拆出，并将其余的部分在2-8℃的暗处存储，避免细菌污染。